分光光度計的基本工作原理是基于物質對光（對光的波長）的吸收具有選擇性，不同的物質都有各自的吸收光帶，所以，當光色散后的光譜通過某一溶液時，其中某些波長的光線就會被溶液吸收。在一定的波長下，溶液中物質的濃度與光能量減弱的程度有一定的比例關系，即符合比爾定律。
分光光度計的構造
分光光度計允許的測定波長范圍在360～800nm，其構造比較簡單，測定的靈敏度和精密度較高。因此，應用比較廣泛。721型分光光度計的儀器構造見下圖。
從光源燈發出的連續輻射光線，射到聚光透鏡上，會聚后，再經過平面鏡轉角90°，反射至入射狹縫。由此入射到單色器內，狹縫正好位于球面準直物鏡的焦面上，當入射光線經過準直物鏡反射后，就以一束平行光射向棱鏡。光線進入棱鏡后，進行色散。色散后回來的光線，再經過準直鏡反射，就會聚在出光狹縫上，再通過聚光鏡后進入比色皿，光線一部分被吸收，透過的光進入光電管，產生相應的光電流，經放大后在微安表上讀出。
分光光度計的使用方法
①首先接通電源，打開電源開關1，指示燈亮，打開比色皿暗箱蓋8，預熱20分鐘。
②波長選擇旋鈕6，選擇所需的單色光波長，用靈敏度旋鈕2選擇所需的靈敏檔。
③放入比色皿，旋轉零位旋鈕5調零，將比色皿暗箱蓋合上，推進比色皿拉桿3，使參比比色皿處于空白校正位置，使光電管見光，旋轉透光率調節旋鈕4，使微安表9指針準確處于。按上述方法連續幾次調整零位和位，即可進行測定工作。
分光光度計使用和維護中應注意事項：
①連續使用儀器的時間不應超過2小時，是間歇0.5小時后，再繼續使用。
②比色皿每次使用完畢后，要用去離子水洗凈并倒置晾干后，存放在比色皿盒內。在日常使用中應注意保護比色皿的透光面，使其不受損壞或產生劃痕，以免影響透光率。
③儀器不能受潮。在日常使用中，應經常注意單色器上的防潮硅膠（在儀器的底部）是否變色，如硅膠的顏色已變紅，應立即取出烘干或更換。
④在托運或移動儀器時，應注意小心輕放。
